Мутацию одной пары нуклеотидов можно охарактеризовать как «замену», когда одно пуриновое основание заменяется на другое (одно пиримидиновое основание — на другое), или как «переключение», когда происходит замена одного класса нуклеотидов на другой. Потеря или вставка одного или нескольких нуклеотидов называется выпадением или включением соответственно. Изменение некоторых пар нуклеотидов является «немым», т. к. не изменяет последовательность аминокислот. Мутации, на-рушающие последовательность аминокислот, называются незначимыми (missence) и консервативными: в белок включается другая аминокислота этого же класса (замена одной нейтральной аминокислоты на другую не нарушает заметно заряд и форму бел-ка). Но возможны нарушения последовательности, связанные с изменением заряда белка, цистеиновых окончаний или аминокислот, которые оказывают заметное влияние на функцию белков. Изменения, приводящие к формированию терминирующего кодона во время считывания, называются «nonsence». Включение или выпадение нуклеотидов, не кратных трем, значительно нарушают считывание ДНК ниже места повреждения.
Точечные мутации. Хроническое воспаление (хронический эзофагит, хронический атрофический гастрит, воспалительные заболевания кишечника) часто является причиной развития рака желудочно-кишечного тракта. При хроническом воспа-лении и так называемом кислородном стрессе происходит образование активных ки-слородных радикалов, гидроксильных радикалов, супероксид-аниона, перекиси водо-рода. Эти реакционноспособные вещества могут усиливать повреждающее действие ио-низирующей и ультрафиолетовой радиации. Активные кислородные радикалы способны вызывать разрыв цепочки ДНК, замену отдельных оснований. Любой участок ДНК в той или иной степени подвергается воздействию мутагенов. Часть мутаций — «немые», другие — нередко изменяют характеристики роста клетки.
Перестройка ДНК. Экспрессия генов может изменяться при значительной перестройке структуры ДНК. Например, при хроническом миелолейкозе происходит транслокация, при которой участки 22-й хромосомы заменяются на клеточный онкоген ABL. Эта транслокация приводит к образованию аномальной иРНК и синтезу большого мутантного ABL белка. Пока еще не понятно, участвует ли этот механизм нарушения регуляции генов в возникновении рака желудочно-кишечного тракта.
Амплификация ДНК. Нормальный ген может трансформироваться в процессе ам-плификации ДНК. Этот механизм широко изучали при исследовании резистентности к химиотерапевтическому агенту — метотрексату, которая возникала при амплификации гена, ответственного за синтез дегидрофолатредуктазы. Амплификация гена рези-стентности к различным препаратам часто встречается при раке кишечника и являет-ся причиной устойчивости опухолей к химиотерапии. Амплификация онкогенов ERBB2, MYC, SRC наблюдается при определенных видах рака желудочно-кишечного тракта.
Нарушение метилирования ДНК. Одним из механизмов контроля экспрессии генов является образование «немых» генов посредством метилирования цитозина. Метилиро-вание ДНК происходит с помощью метилтрансферазы. Паттерн этого процесса «насле-дуется» пролиферирующими клетками в данной ткани. В ткани первичных колоректаль-ных опухолей многие гены оказываются гипометилированными по сравнению с генами клеток нормальной слизистой оболочки. Гипометилирование обнаруживается и в ткани полипов. Оно может быть одним из механизмов канцерогенеза, так как при этом про-цессе изменяется степень метилирования некоторых онкогенов, что сопровождается их активатизацией. Гипометилирование встречается в раковых клетках опухолей же-лудка, пищевода, толстой кишки. Таким образом, нарушение метилирования является характерным для раковых клеток. Гиперметилирование встречается в других участках ДНК раковых клеток и возникает, вероятно, при снижении активности супрессорных генов.
Выпадение генов. Клеточная пролиферация регулируется группой генов, называемых супрессорами опухолевых генов (TSGs). Их функция состоит в предотвращении излишней пролиферации клеток и регуляции числа клеток в ткани. В от-личие от клеточных онкогенов, «участие» этих генов в канцерогенезе в желудочно-кишечном тракте обусловлено либо их инактивацией, либо удалением из ядра клетки.
Теории образования опухолей
Онкогены. Хорошо известно, что одиночная мутация или одиночный поврежденный ген не способны в большинстве клеток вызвать развитие рака. В опухолевых клетках было выявлено большое количество мутаций онкогенов, делеций, а также пе-рестроек хромосом. Но существует теория, согласно которой активация даже одного гена может привести к замене фенотипа клетки на раковый. Эти гены-инициаторы на-званы онкогенами и впервые были выявлены при изучении онкогенных вирусов, спо-собных трансформировать клетки куриных эмбрионов. Обнаружение онкогенов привело к неожиданному открытию: они произошли из нормальных клеточных генов — протоон-когенов. Сейчас открыто более 20 таких генов. Они активируются при точечной му-тации, которая изменяет их нормальную функцию либо приводит к перестройке гено-типа, нарушающей экспрессию генов (табл.10-1).
Некоторые протоонкогены участвуют в передаче сигналов между клеточной мем-браной и ядром. Например, часть онкогенов является факторами клеточного роста, и при нарушении их регуляции происходит постоянная стимуляция тех или иных процес-сов. Другие протоонкогены — это рецепторы для факторов тканевого роста. Наиболее полно изучены RAS-онкогены и связанные с ними гены, участвующие в передаче сиг-налов между клеточной мембраной и ядром. Эти гены активируются при точечной му-тации, что приводит к постоянной активации белков-передатчиков сигнала вне зави-симости от наличия соответствующего лиганда или рецептора. Часть проонкогенов является факторами транскрипции и, взаимодействуя с ДНК, регулирует транскрипцию генов.
Супрессоры опухолевых генов. При раке толстой и прямой кишки отмечаются большие потери генетического материала. Эти участки выпадения («горячие» локусы) являются местами сосредоточения супрессивных генов, потеря которых и приводит к развитию рака толстой кишки. Наиболее важный из них — ген р53, в норме предот-вращающий начало нового периода синтеза ДНК и деления клетки.
Таблица 10-1. ФУНКЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ОНКОГЕНОВ
Из: Hunter T. Cooperation between oncogenes. Cell, 64: 249, 1991
Регуляторный ген (р53), предотвращающий излишнюю пролиферацию клеток, слу-жит супрессивным геном для опухолевых клеток. Характерно, что активация супрес-сорных генов происходит в два этапа. В ядре клетки существует по две копии любо-го гена. Супрессивные гены обладают так называемым «доминирующим» действием, ко-гда для супрессии пролиферации клеток достаточно лишь одной полной копии гена. Теория супрессорных генов согласуется с теорией наследственной предрасположенно-сти к возникновению рака. Инактивация одной из двух аллелей может быть фенотипи-чески «немой» (т. е. не происходит развития злокачественного фенотипа), если достаточно одной (второй) аллели для сохранения незлокачественного фенотипа кле-ток. Но у таких людей особенно высок риск развития рака, т. к. при одной лишь мутации супрессорных генов клетки трансформируются в раковые. В таблице 10-2 приведены наиболее важные гены тканевой супрессии (TSGs).
Образование запретных клонов. Большинство генетических исследований под-тверждают, что опухоль развивается из одной клетки. Принятая в настоящее время теория многоступенчатого канцерогенеза гласит, что эпителий желудочно-кишечного тракта подвергается воздействию вредных факторов окружающей среды. Вследствие этого происходит постепенное повреждение ДНК с накоплением генетических мутаций. При этом мутации обычно возникают в участках ДНК, ответственных за выживаемость и рост клетки. Многие из них способны ингибировать процессы, необходимые для жизнедеятельности клетки, и тем самым привести ее к гибели. Некоторые мутации могут усиливать рост и выживаемость мутированных клеток, позволяя им размножать-ся быстрее, чем окружающие их клетки. В конце концов мутированные клетки начина-ют составлять большую часть органа или ткани. Часть мутированных клеток теряет способность исправлять повреждения ДНК, и, следовательно, из поколения в поколе-ние происходит накопление мутаций. Этот пул клеток также подвержен дополнитель-ным мутациям.
Периодически отдельные клетки мутантного клона подвергаются дополнительной мутации, повышающей их выживаемость и способность к росту. Такие клетки посте-пенно вытесняют из популяции родительские клетки. Увеличение клона мутированных клеток обычно происходит при появлении новых мутаций, которые увеличивают выжи-ваемость клетки. При наблюдении за развитием опухоли на ранней стадии в клетках выявляется определенное количество мутаций, число которых возрастает с течением времени. На Рис. 10-1 показана прогрессия опухоли на фоне появления клонов с но-выми характеристиками.
Таблица 10-2. ПРИМЕРЫ ГЕНОВ, ПОДАВЛЯЮЩИХ РОСТ ОПУХОЛИ У ЧЕЛОВЕКА
Соматические мутации Врожденные мутации
Ген-супрессор опухоли Локус хромосомы Локализация/ предположительная функция Основные типы Примеры опухолей Синдром Количество гетерозигот на 105новорожденных Типичные опухоли
р53 17р13.1 Ядро/фактор транс-крипции Отсутствует Большинство типов рака у человека
Синдром Ли-Фраумени ~2 Карциномы груди, коры надпочечников, саркомы, лейкемия, опухоли мозга
RB1 13q14 Ядро/модификатор транскрипции Делеция и незначимая мутация Ретинобластома, остеосаркома, кар-цинома молочной железы, простаты, мочевого пузыря, легкого Ретинобластома ~2 Ретинобластома, ос-теосаркома
АРС 5q21 Цитоплазма/ неиз-вестно Делеция и незначимая мутация Карцинома толстой кишки, желудка, поджелудочной железы Наследственный аденоматозный полипоз толстой кишки -10 Карциномы толстой кишки, щитовидной железы, желудка
WT1 11р13 Ядро/фактор Отсутствует Опухоль Вильмса Опухоль Вильмса -0.5-1 Опухоль Вильмса
NF1 17q11 транскрипцииЦито-плазма/ГТФ акти-вирующий Делеция Шванномы Нейрофиброматоз (тип 1) -30 Нейрональные опухо-ли
NF2 22q факторЦитоплазма/ мембранные свя
Делеция и незначимая мутация Шванномы и менин-гиомы Нейрофиброматоз (тип 2) -3 Центральные шванномы и менингиомы
VHL Зр25 зи цитоскелета Не-известно Делеция Неизвестно Болезнь ван Хип-пель-Ландау -3 Гемангиобластома, почечно-клеточная карцинома
Многоступенчатый канцерогенез. Концепция генетической основы развития рака толстой кишки была разработана Vogelstein с соавторами. Согласно этой концепции процесс протекает медленно, и в него вовлечено множество генов.
Количество генетических повреждений опухолей постепенно увеличивается по мере роста. Часть повреждений появляется только на ранних стадиях, часть — толь-ко на поздних. Еще до конца не ясна последовательность появления опреде-
Рис. 10-1. Опухолевый рост. На данной схеме представлена типичная последовательность канцерогенеза. На первой стадии показано действие канцерогена. После накопления критической массы мутировапных генов (еди-ной точки зрения на их количество и локализацию нет) клетка превращается в опухолевую. На второй стадии происходит разрастание клона мутировавших клеток с формированием доброкачественной опухоли. Без каких-либо дополнительных воздействий доброкачественная опухоль способна сохранять свою доброкачественность. Но при дополнительном воздействии она трансформируется в злокачественную и приобретает способность к ин-вазивному росту и метастазированию (стадия 3). Не существует единой точки зрения на природу этого воздейст-вия. Злокачественная опухоль склонна к инвазивному росту с повреждением органов хозяина. Генотип злокаче-ственных клеток очень нестабилен, поэтому их клон оказывается гетерогенным (стадии 4 и 5). Клинически такая гетерогенность приводит к формированию отдаленных метастазов. (Но: Yamada Т., Alpers D. H., Owyang С., Роwell D. W., Silverstein F. E., cds. Textbook of Gastroenterology, 2nded. Philadelphia: J. B. Lippincott, 1995:586.)
Рис. 10-2. Схема последовательных генетических изменений в многоступенчатом канцерогенезе при раке тол-стой кишки с дополнениями по Fearon, Vogelstcin. Сверху над схемой показаны мутации, ведущие к потере гете-розиготности (П1), лежащие в основе развития колоректального рака
ленных повреждений в опухолевых клетках, но уже выяснено, что при различ-ных типах рака возможны разные мутации и хромосомные делеции. Для выявления по-тери участков хромосом используются лабораторные методы, а процесс утраты гене-тической информации был назван «потерей гетерозиготности».
В ходе своего развития опухолевая клетка кишечника человека претерпевает опреде-ленные изменения (рис. 10-2). Гипометилирование ДНК происходит на ранних стадиях возникновения канцерогенеза в аденомах. В клетках небольших аденом могут проис-ходить как мутации, так и выпадения участков хромосом, например изменения на 5q хромосоме при аденоматозном полипозе кишки. Обнаруживаемые в крупных аденоматоз-ных полипах мутации генов K-RASvip53 играют заметную роль в поддержании опухоле-вого роста. Делеции генов супрессоров опухолевого роста на 18q (встречается при раке толстой кишки) и 17р (локус гена р53) происходят на поздних стадиях и озна-чают малигнизацию процесса. Несмотря на наличие сходства канцерогенеза в толстой кишке и в других отделах желудочно-кишечного тракта, последовательность измене-ний, а также вовлеченные в процесс гены различны. Детали этих процессов только начинают исследоваться.
Механизмы, замедляющие опухолевую прогрессию. В происхождении опухолей толстой кишки, помимо выпадения супрессорных генов, задействованы и другие механизмы ге-нетических изменений. Микросателлиты — участки ДНК, используемые для картирова-ния генов хромосом. Обычно микросателлиты полностью копируются при репликации клеток, но в некоторых опухолевых клетках отмечается незначительное изменение их длины. Микросателлиты в геноме могут иметь до 103 копий. Было замечено, что в некоторых случаях рака толстой кишки эти микросателлиты копируются не полностью. Наличие «нестабильных» микросателлитов в геноме опухолевых клеток говорит об ут-рате ими способности адекватно копировать гены. Такое нарушение процессов ис-правления мутаций считается еще одним механизмом канцерогенеза. Примерная схема этого механизма приведена на Рис. 10-3.
Развитие опухоли
Потеря контроля над процессом пролиферации. В норме процесс регуляции про-лиферации осуществляется в каждой эпителиальной клетке ЖКТ. При восстановлении эпителия после перенесенной травмы или воспаления эта регуляция ослабевает, и скорость пролиферации увеличивается. После того, как количество вновь образую-щихся клеток сравнивается с количеством отмирающих, скорость пролиферации снижа-ется.
Рис. 10-3. Альтернативный генетический механизм был предложен для многоэтапного канцерогенеза в толстой кишке. Все колоректальные раки накапливают мутации в АРС, K.-RAS-2, р53 локусах с нарушением функции генных продуктов. Вверху показана ситуация, когда нестабильность генома приводит к множественной ПГ. При опухолях в проксимальной части толстой кишки и при врожденном неполипозном раке толстой кишки ПГ наблю-дается редко. У таких больных происходят множественные мутации ДНК, приводящие к нарушению продуктов данного гена. (По: Fearon E. R., Vogelstein В. A genetic model for colorectal tumorgenesis. Cell, 61:759,1990; Aalto-nen L. A., Peltomaki P., Leach F. S., et al. Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer. Science 260 :812,1993; Thibodeau S. N., Bren G., Schaid D. Microsatellite instability in the cancer of the proximal colon. Science, 260: 816, 1993; lonovY., Peinado M. A., Malkhosyan S., et al. Ubiquitous somatic mutations in simple repeated se-quences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis. Nature, 363:558, 1993.)
Установлено, что потеря контроля над процессом пролиферации является ранней стадией канцерогенеза в толстой кишке. Это заключение было сделано на основании того, что у больных с высоким риском развития рака толстой кишки пул пролиферирующих клеток занимает все пространство от основания до верхушки крипт (в норме — только в основании крипт). Но нарушение регуляции пролиферации само по себе не может привести к развитию рака. Для этого необходимы дополнительные, пока неидентифицированные, генетические изменения, вызывающие нарушение клеточ-ной дифференцировки, процессов старения и слущивания клеток. В состав аденомы входят гиперпролиферирующие, незрелые клетки, которые, не имея инвазивной спо-собности, располагаются на слизистой оболочке кишки, образуя полип. Эту стадию развития проходят все опухоли толстой кишки, но она не характерна для опухолей пищевода, желудка и поджелудочной железы.
Рост доброкачественных опухолей. Небольшие аденоматозные полипы встречаются очень часто и обычно не имеют тенденции к дальнейшему росту. Однако с те-чением времени некоторые аденомы увеличиваются и их морфология изменяется. В же-лудочно-кишечном тракте гиперпролиферирующие клетки синтезируют новую ДНК под воздействием содержимого желудочно-кишечного тракта. В норме пролиферация проис-ходит в основании крипты, поэтому вновь образующиеся клетки защищены от содержи-мого просвета кишечника и продуктов метаболизма бактерий. Отсутствие регуляции клеточного роста приводит к накоплению мутировавших клеток, ускорению появления повреждений эпителия и, в свою очередь, усилению клеточного роста.
Образование аденом в толстой кишке носит обратимый характер. Так, у больных с наследственным аденоматозным полипозом после субтотальной колонэктомии на-блюдалось спонтанное исчезновение небольших аденом. Это — генетически детермини-рованное заболевание, при котором мутировавший ген находится в АРС-локусе. Это приводит к появлению большого количества полипов (аденом) либо карциномы на ран-ней стадии развития. У больных со множеством аденом толстой кишки возможна их регрессия на фоне приема нестероидных противовоспалительных препаратов (напри-мер, сулиндака). Механизм процесса инволюции аденом неизвестен. Уже давно уста-новлено, что небольшие аденоматозные полипы могут исчезать без лечения. Это было подтверждено при проведении колоноскопий, но в настоящее время считается, что такие аденомы являются динамической стадией развития неоплазий толстой кишки. Клональный рост клеток может быть связан с увеличением количества факторов рос-та, увеличением числа клеточных рецепторов, нарушением передачи сигналов от кле-точной мембраны к ядру. До сих пор не известно, при какой стадии неопластический процесс может быть остановлен, когда и как происходит регресс опухоли.
Малигнизация опухоли. Субстратом для опухолевого роста является гиперпролиферирующий пул клеток, который длительно подвергается воздействию канцерогенов окружающей среды. В тканях, предрасположенных к малигнизации, любое изменение генотипа может привести к началу роста опухоли. Как уже говорилось вы-ше, существуют два генетических механизма образования рака. Оба этих механизма связаны с изменением гомеостаза клетки при репликации ДНК и хромосом.
Злокачественные клетки обладают способностью постоянного роста, инвазии, образования метастазов. В отличие от доброкачественных опухолевых клеток, они не могут самопроизвольно регрессировать. Постоянный рост злокачественных клеток связан с их генетической нестабильностью. Злокачественные клетки могут в процес-се жизнедеятельности терять белки, что приводит к их гибели. Этим обусловлено появление многочисленных очажков некроза в опухолях. В процессе дальнейших гене-тических перестроек в опухоли могут возникать другие, более жизнеспособные клет-ки, которые постепенно замещают строму опухоли. Вследствие выраженной фенотипи-ческой нестабильности злокачественных клеток среди них постоянно происходит от-бор по способности роста, инвазии, распространения.
Метастазы. Метастазирование опухолевых клеток происходит не случайно. Для этого клетки должны повредить базальную мембрану и другие окружающие их соедини-тельные структуры. Далее клетки проникают в кровеносные и лимфатические сосуды, по ним мигрируют по организму, преодолевая действие его защитных сил. В месте будущего метастаза клетки накапливаются, выходят из сосуда и начинают разрас-таться. Для осуществления этого в клетках должно произойти множество генетиче-ских изменений. Поэтому метастазы появляются на поздних стадиях развития заболе-вания.
Для роста опухолевым клеткам необходимо постоянное кровоснабжение. Кислород может примерно на 100-400 нм проникать из сосуда в ткани, т. е. на диаметр 4—10 клеток (в зависимости от их типа). Опухоли способствуют росту и появлению новых капилляров (неоваскуляризация), что позволяет им выживать при метастазировании. Этот опухолевый ангиогенез стимулируется различными факторами роста, например действием фактора опухолевого ангиогенеза. Место метастазирования может быть случайным, зависящим лишь от кровоснабжения органа. В некоторых органах имеются специфические клеточные рецепторы, способствующие раз-витию опухолевых клеток.
Генетические основы метастазирования еще до конца не изучены. Обнаружен ген, который присутствует в отдаленных метастазах при определенных видах рака. Ген NM23, вероятно, является супрессором метастазов и поэтому практически всегда отсутствует в отдаленных метастазах при раке толстой кишки. Клеточный механизм действия гена NM23 не известен. Скорее всего в образовании метастатического фе-нотипа участвует много генов, их накопление в малигнизированных клетках лежит в основе процесса диссеминации, наблюдаемом при опухолях различного происхождения.